中华人民共和国国家标准
谷类籽粒赖氨酸测定方法
染料结合赖氨酸（ＤＢＬ）法
Method for determination of lysine in cereal grains
－Dye- binding lysine method
UDC 633.1：543：062
GB 4801-84
本标准适用于测定水稻、玉米、高梁、麦类等谷类籽粒的赖氨酸含量。
1 原理
在pH2左右缓冲体系中，样品蛋白质的碱性氨基酸（赖氨酸、组氨酸、精氨酸）可与偶氮磺酸染料酸性橙12等摩尔结合，生成不溶性络合物，其染料结合量（摩尔数）相当于此三种碱性氨基酸的总和。若另取一份样品，先用丙酸酐将蛋白质中赖氨酸的ε－氨基掩蔽（丙酰化作用），使之失去与染料结合的能力，然后再与染料反应，所得染料结合量只是组氨酸和精氨酸之和。根据两次染料结合量的差值，便可算出该样品中的赖氨酸含量。
2 仪器、设备
2.1 分析天平：感量0.4mg。
2.2 实验室用粉碎机。
2.3 ＧＸＤ－201型蛋白质分析仪或ＧＸＤＬ －202型蛋白质赖氨酸分析仪主机。
2.4 实验室用电动往复振荡机。
2.5 离心机：3000～4000r/min。
2.6 30～35ml具塞玻璃管或聚乙烯管。
2.7 定量加液器或移液管：20、2、0.2ml。
2.8 容量瓶：1000、100ml。
3 试剂
试剂除注明者外均为分析纯。
3.1．草酸－乙酸－磷酸盐缓冲溶液：3.4g磷酸二氢钾和20g草酸（Ｈ２Ｃ２Ｏ４·２Ｈ２Ｏ）分别溶于热水后，全部转移到1000 ml容量瓶中。再加入1.7 ml85％磷酸，60 ml冰乙酸，1 ml丙酸，冷却至室温，用蒸馏水定容。
3.2 3.89mM酸性橙12（Ａoid Orange 12，缩写成ＡＯ－12，分子式为Ｃ16Ｈ11Ｏ4Ｎ2ＳＮa，生化试剂，层析纯，含量不少于90％）染料溶液，准确称取1.363g酸性橙12（纯度按100％计），溶解于热的缓冲溶液后，再定量转移到1000ml容量瓶中，冷却至室温，用缓冲溶液定容。
3.3 16％和8％（Ｗ/Ｖ）乙酸钠溶液：称取16.0g和8.0g乙酸钠（按无水乙酸钠计），配成100 ml溶液。
3.4 丙酸酐：化学纯。
4 标准曲线的绘制
配制1.20、1.30、1.40、1.50、1.60、1.70、1.80mＭ酸性橙12染料标准系列溶液，在ＧＸＤ－201型蛋白质分析仪上测定透光率（为提高灵敏度，用连续档测定。即以40 ml3.89mM染料溶液加25 ml缓冲溶液，调透光率为0；40 ml3.89mM染料溶液加125 ml缓冲溶液，调透光率为87）。然后以透光率（％）为纵坐标，染料浓度（mM）为横坐标，在半对数座标纸上绘制标准曲线。或将透光率换算为吸光度，计算回归方程。若用ＧＸＤＬ－202型蛋白质赖氨酸分析仪，则可直接读出吸光度，然后以吸光度Ｅ为纵坐标，染为浓度（mM）为横坐标，在普通坐标纸上绘制标准曲线，或计算回归方程。
5 测定步骤
5.1 试样的选取与制备
选取有代表性谷类籽粒，挑拣干净，按四分法缩减取样，取样量不得少于20g。将籽粒充分风干或放在55～60℃烘箱中干燥六小时以上。带壳水稻、高梁、先脱壳，再用粉碎机粉碎，使90 %以上通过0.25mm筛孔，充分混匀，装入磨口瓶中备用。
5.2 称样
参照表1称样量，称取酰化和不酰化样品各两份，准确到0.4mg，分别放入30～35 ml具塞玻璃管内，标明为Ａ管（酰化样品）和Ｂ管（不酰化样品）。与此同时，另称样品，按GB 3523－83《谷类、油料作物种子水分测定法》测定水分含量。
谷类籽粒的称样量
样 品 名 称 | 酰 化 样 品 | 不 酰 化 样 品 |
水稻 | 0.7或0.8 | 0.5或0.6 |
普通玉米 | 0.8 | 0.6 |
高赖氨酸玉米 | 0.7或0.5 | 0.5或0.4 |
高粱 | 1.0 | 0.7 |
麦类 | 0.5 | 0.4 |
注：称样量系根据试验选定的，如果剩余染料溶液的浓度超出1.2～1.8mM时，称样量应作适当调整。
5.3 丙酰化反应
各管分别加入2.00 ml16％乙酸钠溶液（籼稻加8％乙酸钠溶液），然后加0.20 ml丙酸酐于Ａ管中，加0.20 ml缓冲溶液于Ｂ管中。盖紧塞子，放置振荡机上振荡十分钟。
5.4 染料结合反应
向Ａ、Ｂ管中分别加入20.00 ml3.89mM染料溶液，盖紧塞子，置振荡机上振荡一小时（水稻两小时）。
5.5 离心
将上述反应液于3000～4000r/min下离心十分钟。
5.6 测定
在ＧＸＤ－201型蛋白质分析仪或ＧＸＤＬ－202型蛋白质赖氨酸分析仪上测定上清液（即剩余染料溶液）的透光率Ｔ值或吸光度Ｅ值。
注：一般谷类样品丙酰化反应和染料结合反应不得低于10℃，水稻样品还应在18～34℃下进行。
6 结果计算
6.1 计算公式
由测得的透光率Ｔ值或吸光度Ｅ值，从标准曲线上查出或用回归方程计算得到相应的剩余染料溶液的浓度（mM），则样品中赖氨酸含量的计算公式为
赖氨酸（％，干基）＝
式中：ＣＡ、ＣＢ――分别为酰化与不酰化样品的剩余染料溶液浓度，mM；
ＷＡ、ＷＢ――分别为酰化与不酰化样品的称样量，g；
Ｈ――样品的水分率；
20――加入染料溶液体积，ml；
1.11――（20＋2＋0.2）与20之体积比；
3.89――酸性橙12染料溶液浓度，mM；
146.2――1mol赖氨酸的质量，g。
6.2 结果的表示
两个平行样品的测定结果用算术平均值表示，小数点后保留两位，第三位小数按GB 1.1－81《标准化工作导则 编写标准的一般规定》附录Ｃ规定取舍。
6.3 允许差
两个平行样品赖氨酸测定值差不得大于0.03％。
附 录 Ａ
使用低浓度染料溶液测定法
（参考件）
Ａ.1 本标准采用3.89mM酸性橙12染料溶液。试验证明，使用1.284mM染料溶液，也得到与3.89mM近似的结果，只是在精密度和准确度方面稍差。但低浓度有其优点，即不论那类谷物，称样量一律定为0.18g（0.20 g）和0.13 g，且可节约试剂及样品用量。
Ａ.2 用1.284mM染料溶液时,其测定方法除下述几点有所不同外，其余均与标准条文条款相同。
Ａ.2.1 称样量均为0.18 g（粳稻为0.20 g）和0.13 g。
Ａ.2.2 绘制标准曲线：配制0.50、0.55、0.60、0.65、0.80、0.80、0.90mM的染料标准系列溶液（用连续档测定，以1.284mM染料溶液调透光率为10，60ml1.284mM染料溶液加140 ml缓冲溶液调透光率70）。
附加说明：
本标准由中华人民共和国农牧渔业部提出。
本标准由中国农业科学院综合分析室查如璧主持起草。
