中华人民共和国国家标准
谷物和谷物产品α－淀粉
酶活性的测定 比色法
Method for determination of alpha-amylase
Activity in cereal and cereal products colorimetric method
GB 5521－89代替GB 5521－85
本标准等效采用国际标准ISO 3983－1997 《谷物和谷物产品α－淀粉酶活性的测定 比色法》。
1 主题内容和适用范围
本标准规定了用比色法测定谷物和谷物产品α－淀粉酶活性所用仪器、试剂、分析步骤和结果计算。
本标准适用于测定谷物和谷物产品α－淀粉酶活性，也可用于测定源于真菌或细菌的α－淀粉酶干粉的活性。
2 定义
1L溶剂从1g样品中所提取的酶，在规定条件下，每秒钟降解1.024×10-5单位的β-极限糊精底物溶液，则该样品的α－淀粉酶活性等于一个单位，极限糊精是被β－淀粉酶完全降解了的淀粉产物。
3 原理
酶降解β-极限糊精底物溶液，经过不同的反应时间，将反应混合物等分加到碘溶液中。随着反应时间的增加而使颜色强度降低，以测定酶活性。
4 试剂
4.1 碘(GB 678－77)；
4.2 碘化钾（GB 1272－77）；
4.3 冰乙酸（GB 676－78）；
4.4. 硫酸(GB 625－78)；
4.5 无水乙酸钠（GB 694－81）；
4.6 氯化钙；
4.7 可溶性淀粉1)；
注：1) 可采用Lintner淀粉或质量相当的国产可溶性淀粉。浙江菱湖化工试剂厂产品符合要求。
4.8 浮石粉；
4.9 碘贮备液：
称取11.0g碘化钾溶于少量水中，加入5.50g结晶碘，搅拌至碘完全溶解。再定容至250mL，置于棕色瓶中，在暗处贮存，此溶液可保存一个月。
4.10 碘稀释液：
称取40.0g碘化钾溶于水中，加4.00mL碘贮备液，并稀释至1L，用时现配，不可过夜；
4.11 缓冲液：
称取164g无水乙酸钠溶于水中，加入120mL冰乙酸用水定容至1L；
4.12 0.2%（m/V）氯化钙溶液；
4.13 0.05mol/L硫酸溶液：
4.14 β-淀粉酶溶液：
称取10g有酶活性的黄豆粉（粗细度为通过1.5mm孔筛），加入85mL水和15mL 0.05mol/L硫酸充分搅匀，静置15min，抽滤，该滤液用于制备β-极限糊精底物溶液；
4.15 β-极限糊精底物溶液：
称取5.00g（干基）可溶性淀粉于小烧杯中，加入约20mL水混匀，将其边搅拌边缓慢倒入盛有100mL沸水的500mL高型烧杯中，并用洗瓶将小烧杯中的淀粉全部转移至高型烧杯中，继续搅拌并加热，缓慢煮沸2min。加盖表面皿，在自来水中冷却至30℃以下，加入25mL缓冲溶液及50mLβ-淀粉酶液，在室温下放置20h，加入1勺浮石粉，将此溶液在10min之内缓慢煮沸，然后继续沸腾5min以上。冷却至30℃以下，用水定容至250mL，摇匀，过滤。滤液中加几滴甲苯，此溶液的pH值应为4.7±0.1，在25℃以下可连续使用五天。
5 仪器
5.1 恒温水浴，30±0.1℃；
5.2 恒温水浴，20±0.1℃；
5.3 分光光度计或比色计；
5.4 秒表；
5.5 筛子：孔径为1.0mm、1.5mm；
5.6 pH计。
6 分析步骤
6.1 分光光度计及其空白调整：
将分光光度计连接稳压电源，预热20min，调整波长为575nm。将2.0mL氯化钙溶液加到10.0mL稀碘溶液中，然后以适量的水Ｖ0稀释（加水量一般为20～40mL，Ｖ0详见6.2），混匀后达到20℃，用25px比色皿进行测试，调节仪器狭缝宽度，使吸光度为零。
6.2 底物溶液的校准：
分别吸取5.0mLβ-极限糊清溶液和 15.0mL 氯化钙溶液于一个100mL烧杯中，混匀取出2.0mL混合液至另一个100mL烧杯中，加入 10.0mL稀碘溶液和适量的水， 混匀置于20℃水浴中，用25px比色皿在波长575nm处，以6.1所用溶液为参比，测其吸光度。调整加水量，使测得的吸光度在0.55～0.60之间，如果测得吸光度大于0.60则增大加水量，如果测得值少于0.55则减少加水量。通过反复试配，直至测定的吸光度值在0.55～0.60之间，记下此时的加水量Ｖ0，并用它调整空白溶液的加水量Ｖ0即为该β-极限糊精测试时的加水量。
6.3 α-淀粉酶的提取：
称取谷物样品约5g（精确到0.05g），倒入300mL锥形瓶中，加入预热到30℃的氯化钙溶液100±0.5mL，充分摇匀，置于30℃的恒温水浴中。在15、30、45min时从水浴中取出，上下颠倒锥形瓶10次，重新置于水浴，共提取60min。取出过滤，滤液即为酶提取液。
6.4 α-淀粉酶活性的测定：
把酶提取液和β-极限糊精溶液置于30℃水浴中，10min后用快速移液管吸移5.0mL β-极限糊精溶液至盛有15.0mL酶提取液的锥形瓶中，加塞后摇匀。在加液的同时，用秒表计时。吸取10.0mL稀碘溶液于各个50mL容量瓶中，加入Ｖ0mL水，混匀加塞后置于20℃水浴中，每隔5min或10min进行下列操作：
6.4.1 吸取2.0mL酶、β-极限糊精混合液到一个盛有稀碘溶液和Ｖ0mL水的容量瓶中，摇匀后置于水浴，使溶液温度达到20℃。
6.4.2 倒入比色皿测其吸光度。
7 结果计算
α-淀粉酶活性由下式求得：
式中：Ａ――α-淀粉酶活性，单位；
m――100mL氯化钙提取的试样质量，g；
h――试样中水分含量，%；
f――酶提取液的稀释倍数；
t1、t2――不同的反应时间，min；
D1、D2――时间t1、t2的吸光度；
b――1gD对t的曲线的斜率的绝对值；
500――系数。
7.2 计算举例：
含14.6%水分的样品5.20g，用100mL氯化钙溶液提取。由于酶提取液与极限糊精的反应速度太快，故用氯化钙溶液稀释酶提取液，１份酶提取液加1.5份氯化钙溶液。因此f=1+1.5=2.5。β-极限糊精与酶提取液混合后，间隔5，10和20min后，吸光度分别为：
时间，min 吸光度D 1gD+1
5 0.498 0.697
10 0.425 0.628
20 0.308 0.489
根据5min和10min后的观察结果：
用三个观察结果作1gD对t的曲线（见图）。
把b=0.01391代入公式得：
7.3 结果的重复性：
同一实验室同时或连续两次测定结果之差，不得超过平均值的10%，如果两次测定结果符合要求，则取结果的平均值。按下表修约：
活性，单位 | 修约成整数范围，单位 |
＜50 50～500 500～5000 5000～50000 | 0.1 1 10 100 |
注：①测定过程中应合理调整酶的浓度，使35%～60%的β-极限糊精在15～40min内降解，即最后测得的吸光度为底物校准时吸光度的40%～65%。如果吸光度降得太快，则酶液可用0.2%的氯化钙溶液再稀释。如酶的活性太快，为获得正确结果，可将反应时间延长60min以上。
②在用分光光度计测定吸光度时，溶液的温度对结果有影响，必须控制在20℃在6.4的操作中，从显色到测定吸光度的间隔时间一般对结果没有影响，如测定一系列样品，可在所有样品均完成显色后再一起测定吸光度。但最长间隔时间不得超过1h。
附加说明：
本标准由中华人民共和国商业部粮食储运局提出并归口。
本标准由商业部谷物油脂化学研究所起草。
本标准主要起草人王维光。
